虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能研究

【摘要】卵黄蛋白原（Vitellogenin）是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体，是一种富含磷、糖、脂的大分子蛋白。为人们熟知的是，卵黄蛋白原在卵母细胞中经蛋白酶解成卵黄蛋白，为胚胎和幼体的生长提供主要的营养物质。然而，研究表明卵黄蛋白原的生物学功能远不止于此。研究显示，鱼类卵黄蛋白原具有免疫功能，能够参与免疫防御反应。但低等的海洋贝类卵黄蛋白原是否也具有免疫功能还不清楚。虾夷扇贝（Patinopectenyessoensis）是我国重要的经济养殖贝类，近年来，该产业面临着夏季成贝大面积死亡和幼虫培育前期可能发生的批量死亡的巨大挑战。对于主要依靠非特异性免疫进行机体免疫防御的虾夷扇贝来说，挖掘新的免疫因子，研究其免疫活性具有十分重要的理论价值和现实意义。为此，本论文以虾夷扇贝为材料，主要进行了卵黄蛋白原基因克隆、表达、纯化及免疫活性的研究，并初步探索了C型凝集素母源免疫作用。论文主要进行了虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能方面的研究。首先，克隆获得了虾夷扇贝卵黄蛋白原基因cDNA全长，并研究了卵黄蛋白原的时空表达模式以及对鳗弧菌（Vibrioanguillarum）刺激的响应规律；其次，成功地运用原核表达系统对卵黄蛋白原的结构域DUF1943和VWD进行了体外重组表达，研究了这两个结构域与细菌、病原相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP）脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA）的结合作用。最后，我们从虾夷扇贝卵巢中分离纯化到了天然卵黄蛋白原蛋白并进行了抑菌实验。运用同源克隆策略和cDNA末端快速扩增（rapid-amplificationofcDNAends，RACE）技术获得了虾夷扇贝卵黄蛋白原（PyVg）基因全长cDNA序列。序列全长为7707bp，开放阅读框（openreadingframe，ORF）的长度为6888bp，共编码2295个氨基酸残基，其起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。预测的成熟蛋白分子量大小为265.14kDa，等电点为8.36。推断的氨基酸序列含有16个氨基酸残基的信号肽，存在一个类枯草杆菌的内切酶识别的裂解位点R-X-R/K-R（本研究中为RDRR），三个潜在的N-连接糖基化位点，以及在无脊椎动物和脊椎动物中都比较保守的“KTIGNAG”基序（motif）和“CGLC”基序。SMART分析结果显示，PyVg的结构域包含Vitellogenin_N、DUF1943（domainofunknownfunction）以及VWD（vonWillebrandfactortypeDdomain），这三个是卵黄蛋白原基因家族保守的结构域。PyVg氨基酸序列与栉孔扇贝（Chlamysfarreri）和华贵栉孔扇贝（Mimachlamysnobilis）等亲缘关系较近的海洋贝类相似度较高，与其他昆虫、鱼类、甲壳类等动物也具有一定的相似性，但相似性高的区域主要集中在N端，其次为C端，中间序列保守性不强，变化较大。RT-PCR研究了PyVg的时空表达模式。半定量RT-PCR结果显示，PyVg在雌性虾夷扇贝卵巢和肝胰腺中表达，其中卵巢的表达量相对高于肝胰腺，雌性个体的其他组织以及雄性个体中未检测到PyVg的表达；qRT-PCR结果表明，长岛海区虾夷扇贝卵巢中的卵黄蛋白原在5月份表达量最低，8月份以后开始逐步上调，10月表达量积累速度加快，次年1月份表达量与前几个月产生显著性差异，2月份表达量上升至最高值，之后开始下降。PyVg在卵巢中的表达变化规律反映了该海区虾夷扇贝性腺的发育过程，说明卵黄蛋白原是卵黄合成的重要物质基础；qRT-PCR检测了PyVg受到鳗弧菌刺激后的反应模式，结果表明，受到细菌刺激后，卵巢组织中的卵黄蛋白原mRNA表达量逐步上调，至4h时表达量与对照组产生显著差异，8h表达量继续增加，至12h达到了最高值，是对照组的70多倍。之后，PyVg表达量急剧下降，至48h基本下降至对照组水平。PyVg对细菌刺激的响应有明显的时间依赖性，具有急性时相反应特点，这表明PyVg可能作为免疫因子参与到了机体的免疫反应过程。运用原核表达系统成功表达了来源于PyVg基因的两个结构域DUF1943和VWD，并研究了这两种重组蛋白结合细菌和LTA、LPS的能力。结果表明，这两种重组蛋白不仅能够与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichiacoli）、鳗弧菌结合，而且还能够与其表面的病原相关分子模式LTA和LPS结合，不过这两种重组蛋白对细菌生长均没有显著的抑制作用；这说明，结构域DUF1943和VWD能够作为模式识别受体发挥免疫学活性，这是除斑马鱼（Daniorerio）外，在低等的无脊椎动物中首次报道。为此，我们通过DEAE-32阴离子交换柱层析和SephacrylS-100葡聚糖凝胶过滤层析从虾夷扇贝的卵巢中，分离纯化到了天然卵黄蛋白原蛋白，研究了该蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、鳗弧菌的抑菌作用。结果表明，纯化到的虾夷扇贝卵黄蛋白原能够显著抑制这三种细菌的生长，而且抑制作用具有明显的浓度依赖性。这是在海洋贝类中首次发现卵黄蛋白原具有免疫学功能。论文的第二部分对虾夷扇贝C型凝集素的母源传递及其抑菌作用进行了初步探索。运用qRT-PCR技术检测了鳗弧菌刺激对虾夷扇贝卵巢中C型凝集素表达的影响，和C型凝集素基因在虾夷扇贝卵子以及胚胎发育早期的变化；通过抑菌实验研究了卵子胞浆中C型凝集素对细菌生长的抑制作用。结果表明，鳗弧菌刺激能够引起虾夷扇贝卵巢中的C型凝集素基因表达量的显著变化，最高表达量出现在刺激后8h，处理组是对照组的6.2倍；鳗弧菌处理组和对照组的卵子和胚胎中都能够检测到C型凝集素转录本的表达，处理组的表达量极显著高于对照组，但两组的表达量都随着胚胎发育逐渐降低，至受精36h时分别为正常卵子的0.3和0.2倍；蛋白终浓度为200μg/ml和400μg/ml的卵细胞质都具有抑菌作用，而加入C型凝集素抗体反应后，细菌存活率显著上升，说明母源C型凝集素能够抑制细菌的生长。本研究初步探索了虾夷扇贝C型凝集素的母源传递和抑菌作用，为贝类母源免疫研究提供了基础资料。
【作者】吴彪；
【导师】张士璀；
【作者基本信息】中国海洋大学，发育生物学，2014，博士
【关键词】虾夷扇贝；卵黄蛋白原；基因克隆和表达；免疫功能；C型凝集素；母源免疫；

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